赛默飞（Thermo Fisher）的自动细胞计数仪（以 Countess 系列为主，如 Countess II、Countess 3、Countess 3 FL）在实验室中使用非常普遍。用户在实际操作中遇到的技术性问题通常集中在成像质量、算法识别、样本制备和硬件维护四个方面。以下是常见问题及可能原因的系统梳理：

一、成像相关问题（图像模糊、亮度异常、有杂质）

1、图像整体模糊，细胞边缘不清晰

技术原因：

（1）未正确对焦：Countess II 是固定焦距（依赖玻片卡槽精度），若玻片未推入或卡槽内有异物，会导致焦距偏移。

（2）镜头脏污：物镜表面有灰尘、指纹或残留的台盼蓝结晶。

（3）玻片质量问题：反复使用的玻片划痕严重或底部不透明。

2、图像过亮或过暗，细胞不可见

（1）照明LED老化或亮度设置不当（部分型号可手动调节曝光/增益）。

（2）台盼蓝浓度过高：染色过深，吸光太强，导致活细胞区域全黑。

（3）未使用台盼蓝但选择了“活率”模式。

3、视野中出现大量气泡、纤维或块状物

（1）样本未充分混匀，或有沉淀。

（2）玻片注入时产生气泡，算法会误判为细胞碎片。

（3）培养液中的蛋白或血清絮状物未去除。

二、计数和活率识别错误（算法问题）

这是用户Z常抱怨的技术痛点，尤其在处理团块细胞、不规则细胞或低活性样本时。

1、细胞团块被计为单个细胞，或团块被忽略

算法：默认的“细胞分割”算法对紧密连接的细胞团分辨率有限。即便调节“细胞直径范围”和“团块分离强度”参数，仍可能失效。

2、台盼蓝染色细胞活死判别不准

算法：

（1）染料与细胞比例不当：台盼蓝终浓度应为0.2-0.4%，过浓会使活细胞也被染成浅蓝色。

（2）细胞染色时间过长（>5分钟）：活细胞也会吸收染料，导致假阳性死亡。

（3）死细胞破裂：碎片与台盼蓝结合，被误判为死细胞。

3、小细胞（如PBMC、原代神经元）被漏计

算法：默认的细胞尺寸下限（通常4-6 μm）过滤掉了更小的细胞。用户需手动设置“Z小细胞直径”。

4、细胞碎片或灰尘被误计为细胞

算法：背景噪声阈值设置过低。在“高级设置”中提高“亮度阈值”可减少误计。

5、活率结果忽高忽低，重复性差

算法：

（1）样本上样前未充分吹打混匀。

（2）同一个玻片的不同视野差异大（细胞沉降不均）。

（3）仪器未进行背景校正（某些型号需要定期做空白校正）。

三、硬件及耗材相关故障

1、仪器无法启动、屏幕不亮

原因：电源适配器损坏、保险丝烧断、内部电池（如有）耗尽。

2、玻片无法被识别或卡滞

原因：玻片尺寸不标准（非原装耗材）；卡槽内有残留胶水或碎屑；传感器脏污。

3、计数结果总显示“误差过高”或“浓度超出范围”

原因：细胞浓度过高（>1e7/mL）或过低（<1e4/mL），超出线性范围。建议稀释或浓缩后再测。

4、聚焦后图像边缘模糊

可能是镜头组件松动或载物台不平，需要专业校准。

四、软件与数据管理问题

1、无法保存图像或导出数据：USB端口故障、U盘格式不兼容（需FAT32）、固件版本过低。

2、自定义细胞类型参数丢失：Countess 3 支持保存多个实验模板，但若用户未正确保存或仪器恢复出厂设置，参数会丢失。

3、Wi-Fi/网络连接失败（仅限Countess 3 FL等支持云功能的型号）：网络配置错误或防火墙阻拦。

五、用户操作不当导致的“伪技术问题”

这些不是仪器本身的故障，但常被误认为是技术问题：

1、加样前未将细胞吹打成单细胞悬液

后果：计数结果严重偏低，活率假性降低（因为团块中央细胞染不上台盼蓝）。

2、用酒精或强酸清洁镜头

后果：损坏镜头镀膜，导致模糊。

3、使用非专用计数板（如血球计数板）

后果：Countess 系列只能使用专用一次性玻片，否则无法对焦和识别。

4、样本中混有磁珠或微载体

后果：被计为细胞，严重干扰结果。

六、如何快速排查技术问题（实用步骤）

1、对照标准品：使用仪器附赠的质控微球（已知浓度和活率）检测仪器是否准确。若质控正常，则问题出在样本制备。

2、清洁镜头和玻片卡槽：用镜头纸 + 70%异丙醇轻轻擦拭物镜，用棉签清理卡槽边缘。

3、调整成像参数：在手动模式下调节亮度、曝光时间、增益，直到细胞与背景对比清晰。

4、优化算法设置：

（1）设置合适的细胞直径范围（如CHO细胞 10-35 μm，HEK293 8-25 μm）。

（2）开启或关闭“团块分离”功能。

（3）调整“背景阈值”去除碎片干扰。

5、验证染色：在显微镜下目视观察同一份样本的台盼蓝染色情况，确认细胞活率与仪器结果大致相符。

七、总结：常见且难解决的技术问题

1、细胞团块导致计数偏低 – 没有算法解决方案，只能在实验前优化消化和吹打步骤。

2、小细胞或原代细胞识别不准确 – 需要用户根据经验手动设定Z小直径和亮度阈值。

3、台盼蓝染色不均或过度染色 – 需严格控制染色时间和染料终浓度，不同批次台盼蓝存在差异。