Bio-Rad伯乐T100梯度PCR仪器的详细操作使用指南。无论您是初学者还是需要复习，按照以下步骤都能安全、准确地完成实验。

一、伯乐T100梯度PCR系统创建和运行程序

T100的界面非常直观，主要通过旋钮和按钮进行操作。屏幕会显示清晰的菜单。

1、步骤1：创建新程序或选择已有程序

新程序： 在主菜单，转动旋钮选择 “New Protocol” ，然后按旋钮确认。

已有程序： 选择 “Saved Protocols”，从列表中找到您之前保存的程序，按“Run”运行。

2、步骤2：设置温度与时间（程序核心）

一个标准的PCR程序通常包含以下步骤，您需要逐一设置：

（1）热盖温度：

仪器会自动提示设置热盖温度。为了防止液体蒸发，请将其设置为 105°C。这是T100的推荐值，务必确保热盖紧密压住管盖。

注意： 如果您使用的是带有热盖密封膜的96孔板，也需要将热盖温度设为105°C。

（2）预变性：

这是第一个高温步骤，用于彻底激活热启动酶并使模板DNA完全变性。

温度： 94°C - 98°C （根据您使用的DNA聚合酶说明书推荐设置，常用 95°C）。

时间： 2 - 5分钟。

（3）变性：

温度： 94°C - 95°C

时间： 20 - 30秒

退火：

这是使用梯度功能的关键步骤！

设置梯度： 在设置退火温度时，屏幕会提示您是否启用梯度。选择“Yes”或“Gradient”。然后您需要设置一个温度范围。

例如： 您想测试55°C到65°C之间的Z佳退火温度。您可以设置 Gradient: 55 - 65°C。仪器会自动在样品槽的不同列生成一个温度梯度（例如，从左到右：55°C, 57°C, 59°C, 61°C, 63°C, 65°C）。

（4）Z终延伸：

在所有循环结束后，进行一次充分的延伸，确保所有PCR产物都是全长的。

温度： 72°C

时间： 5 - 10分钟。

（5）Z终保存：

反应结束后，保持样品在低温以防止降解。温度： 4°C 或 10°C

时间： 无限期（“Forever”），直到您取出样品。

3、步骤3：设置循环数

在设置完所有温度步骤后，系统会提示您设置第3步（循环扩增）的循环次数，通常设为30-35个循环。

4、步骤4：命名和保存程序

程序设置完成后，系统会提示您为程序命名（例如，“Mouse_GeneX_Gradient”）。

建议使用一个能清晰反映实验内容的名称，然后选择“Save”保存。这样下次可以直接调用。

5、步骤5：运行程序

（1）放置样品： 将盖紧的PCR管或96孔板平稳地放入仪器的样品槽基座上。确保管盖完全闭合。

（2）下拉热盖： 用力且平稳地将仪器上方的热盖向下压到底。您会感觉到明显的阻力，这表明热盖已经压紧样品管。

（3）开始运行： 在屏幕上确认程序信息无误后，按下 “Start Run” 按钮。

（4）运行监控： 仪器开始运行，屏幕上会显示当前运行的步骤、剩余时间、当前温度等信息。您可以随时监控运行状态。

二、伯乐T100梯度PCR运行后操作

1、运行结束： 当程序运行完毕，仪器会发出蜂鸣声提示，并显示“Run Complete”。

2、取出样品：

先抬起热盖！ 小心地向上打开热盖。

戴上防烫手套或用镊子取出PCR管/板，因为样品槽可能还很热。

立即将PCR产物置于冰上或转移到4°C冰箱保存，以备后续的电泳或分析。

3、关闭仪器： 如果接下来没有其他用户使用，可以关闭电源。

三、重要注意事项与技巧

1、梯度PCR设计： 利用梯度功能可以快速优化退火温度。建议在预估Z佳退火温度上下各设置5°C的范围。

2、热盖是关键： 热盖未压紧或温度设置错误是导致实验失败的常见原因。务必确保热盖压紧且温度为105°C。

3、防止污染： 始终使用无菌的枪头和试管，在干净的区域配制反应体系，以防止DNA污染导致假阳性。

4、程序验证： 首次运行新程序时，可以不放样品，空跑一个程序，观察温度变化是否正常，这被称为“干运行”。

5、日常维护： 保持样品槽的清洁。如果有液体洒出，请立即用70%乙醇擦拭干净。