使用伯乐T100梯度PCR仪时，除了遵循常规PCR操作规范外，还有一些针对该型号仪器的关键细节和注意事项。熟练掌握这些细节能显著提高实验的重复性和成功率。以下是从操作前、操作中到操作后的详细注意事项：

一、BioRad伯乐T100PCR仪 开机前与程序设置阶段

1、仪器预热与校准：

（1）仪器刚开机，建议预热10-15分钟，让热盖和样品槽温度稳定，确保温度的准确性。

（2）定期进行温度校准（尤其是当实验结果出现系统性偏差时）。这通常需要使用专用的校准仪或由专业技术人员完成。

2、程序设置与验证：

（1）理解梯度功能： 明确梯度的设置范围。T100的梯度功能是在样品槽的同一排（通常是纵向） 设置一个线性温度梯度。例如，设置梯度为60°C到50°C，意味着同一排从左到右（或从右到左）温度线性递减。请勿在设置梯度的一排放置不同引物或模板的样品，否则结果无法解读。

（2）合理设置梯度范围： 初次进行退火温度优化时，梯度范围可以设宽一些（如10-12°C）。根据结果缩小范围进行精细优化。范围过宽可能会超出酶的适宜温度。

（3）确认热盖温度： 根据使用的管型（如0.2mL单管、八连排管）正确设置热盖温度。通常使用默认的105°C即可，确保管盖被紧密压住，防止蒸发。

（4）程序命名与保存： 为每个程序设置一个清晰易懂的名称并保存，避免下次使用时输错参数。

二、伯乐T100梯度PCR仪样品准备与放置阶段

1、样品管选择与质量：

（1）使用平盖、薄壁的专用PCR管/板。管壁厚度不均或拱形盖会严重影响热传导，导致温度不准和蒸发。

（2）确保管盖紧闭。放置前，可以用指尖轻轻按压每个管盖确认。

2、反应体系配置：

（1）确保反应液在管底，不要挂在管壁或盖上。短暂离心将所有液体收集到管底。

（2）体系体积不宜过小，对于0.2mL的管，建议不少于10μL，以保证温度感应的准确性。

3、样品放置的“黄金法则”：

（1）对称放置： 无论是否使用梯度，都尽量将样品对称放置在样品槽中。这有助于热场均匀，减少边缘效应。

（2）梯度实验的放置： 进行梯度实验时，必须将同一反应体系的多个重复样本，放置在梯度设置的那一排上。例如，你要优化一个引物的退火温度，你需要准备8个完全相同的PCR反应管，然后全部放在仪器上用于梯度的那一排（通常是纵向的一列），仪器会自动为每个管分配不同的退火温度。

（3）非梯度实验的放置： 即使不做梯度实验，也建议将样品放在样品槽中央区域，避免Z外圈，因为边缘的温度波动可能稍大。

（4）标记位置： 在放置样品时，Z好在管盖或排架上用记号笔标记位置（如A1， B2），以便后续准确记录哪个样品在哪个位置。

三、伯乐T100梯度PCR仪运行阶段

1、运行前Z终检查：

（1）再次确认程序参数（温度、时间、循环数）是否正确。

（2）确认热盖已经紧密闭合，听到“咔嗒”声。

（3）检查仪器屏幕显示的状态是否为“Ready”或“Idle”。

2、运行中：

（1）仪器运行时，请勿频繁打开热盖，这会严重干扰温度控制。

（2）注意观察仪器运行是否正常，有无异常报警声。T100的屏幕会显示当前运行的步骤和剩余时间。

四、 运行结束后

1、取回样品：

（1）程序结束后，仪器会自动将样品槽降温至4°C或12°C（根据设置）进行保温。尽快取出样品，以免冷凝水在管内积聚。

（2）取出时小心烫伤，虽然样品槽温度不高，但热盖部分可能仍有余温。

2、数据记录：

这是梯度PCRZ关键的一步！ 立即记录下每个样品在样品槽中的精确位置以及该位置对应的实际梯度温度。你可以在仪器的运行日志或程序结果中找到这个温度列表。没有这个对应关系，梯度实验就失去了意义。

3、仪器维护：

（1）保持清洁： 定期用70%乙醇湿润的无尘纸擦拭样品槽和热盖，去除灰尘、油污和溢出的样品。切勿使用强酸、强碱或高浓度酒精，以免腐蚀金属表面。

（2）防止污染： 如果有样品泄漏，务必立即彻底清洁，防止基因组DNA或PCR产物交叉污染后续实验。

（3）长期不用： 如果长时间不使用，请拔掉电源，并用防尘罩盖好。

总结：

使用伯乐T100的核心在于 “理解梯度、规范放置、准确记录” 。只要在实验设计时想清楚如何利用梯度功能，在操作时细心规范，并养成及时记录的好习惯，就能充分发挥这台高性能仪器的优势，为您的实验带来极大的便利。