伯乐（Bio-Rad）的CFX系列实时荧光定量PCR仪，包括经典的CFX96/384以及您提到的CFX Duet，是全球应用非常广泛的qPCR平台。它支持主流的全部检测化学方法。对于在CFX Duet上进行实验，常用的染料主要分为两大类：非特异性染料（SYBR Green）和特异性探针（如TaqMan等）。

一、伯乐CFX DUET实时荧光定量PCR仪SYBR Green 染料法

1、通用型：

（1）SYBR® Green I： 黄金标准。几乎所有品牌的SYBR Green qPCR预混液（Master Mix）都基于此染料。Bio-Rad自家也提供SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix 等明星产品，特点是含有高保真、热启动的Sso7d融合酶，特异性高，可防止引物二聚体的干扰。

（2）常用品牌： Bio-Rad、Takara、Thermo Fisher、Qiagen、NEB等公司的SYBR预混液均可完美兼容。

2、增强型/高特异性型：

（1）一些预混液中会添加特殊成分（如荧光染料、抗体或修饰酶）来进一步提高特异性和信噪比。

（2）例如： EvaGreen® 也是一种常见的DNA结合染料，其饱和浓度更高，在某些应用中可能比SYBR Green I更稳定。CFX Duet同样完全兼容。

3、何时选择？

基因表达分析（相对定量）。

基因型筛选、熔解曲线分析。

当需要快速优化或检测多个靶点时（成本低，只需设计引物）。

二、伯乐CFX DUET实时荧光定量PCR仪特异性探针法

1、TaqMan® 水解探针（Z主流）：

（1）探针5‘端带报告荧光基团（如FAM），3’端带淬灭基团（如TAMRA, BHQ）。PCR延伸时，Taq酶的水解活性将探针切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光。

（2）CFX Duet完全兼容所有TaqMan探针检测。仪器预设了常见荧光基团（如FAM, HEX/VIC, CY5, ROX等）的检测通道。

（3）常用试剂： Bio-Rad的SsoAdvanced™ Universal Probes Supermix， 或TaqMan™ Universal Master Mix II（来自Thermo Fisher）等。

2、分子信标：

（1）茎环结构的探针，在结合靶序列后构象改变，使荧光基团和淬灭基团分离而发光。特异性也非常高。

（2）同样兼容CFX Duet。

3、FRET杂交探针（如用于基因分型的探针）：

（1）使用两个相邻的探针，一个带供体荧光基团，一个带受体荧光基团。当两者靠近时发生能量转移。适用于高分辨率熔解曲线分析。

（2）在一些特殊的SNP分型应用中使用。

4、何时选择？

绝对定量（如病毒载量检测）。

多基因同时检测（多重PCR）。

特异性要求极高的应用（如区分同源序列）。

SNP分型。

三、 高分辨率熔解曲线染料

这类染料饱和结合DNA，可用于区分序列差异（如SNP、突变检测），通常不与SYBR Green混用。

LCGreen®, SYTO®9 等。

在CFX Duet上运行后，通过其精确的温控和荧光采集功能进行高分辨率熔解曲线分析。

四、操作建议：

1、确定实验目的： 是看表达量（相对定量）还是精确拷贝数（绝对定量）？是否需要区分非常相似的序列？

2、根据目的选择化学方法： 大部分表达分析用SYBR Green即可；病毒检测、多重检测用TaqMan探针。

3、选择成熟的商业预混液： 对于新手和常规实验，强烈建议购买包含热启动酶、dNTPs、Mg²⁺、优化缓冲液和染料的2× qPCR Master Mix。这是Z简单可靠的方式。

SYBR法： 可选用 Bio-Rad SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix。

探针法： 可选用 Bio-Rad SsoAdvanced Universal Probes Supermix。

4、在CFX Duet软件中正确设置：

选择正确的检测化学（“SYBR” 或 “TaqMan”）。

选择正确的荧光通道（SYBR用FAM通道；TaqMan根据探针报告基团选择FAM、HEX、CY5等）。

关键： 选择与您所用预混液匹配的被动参考染料（通常是ROX）。这一步设置错误会导致数据异常。

总之，伯乐CFX Duet是一款功能全面的仪器，支持市场上几乎所有主流的qPCR染料和化学方法。您只需要根据实验需求进行选择，并在软件中做好对应设置即可。