伯乐（Bio-Rad）CFX Duet实时荧光定量PCR仪的性能验证，通常包括以下几个核心部分。这些验证旨在确保仪器运行状态良好，数据准确可靠，符合实验室质量管理要求。验证可以分为安装/维修后的IQ/OQ验证和日常/周期性性能监控两部分。

一、伯乐CFX Duet实时荧光定量PCR仪安装/运行确认

这部分通常由工程师执行，并提供报告，但用户需知晓内容。

1、安装确认：检查仪器部件是否齐全、安装环境（电源、空间、温湿度）是否符合要求、软件安装与授权等。

2、运行确认：通过运行一系列标准测试来验证仪器的关键性能指标。

（1）光学检测：使用荧光染料板（如ROX、FAM等）检查所有激发/检测通道是否正常工作，背景噪音是否在允许范围内。

（2）温度梯度验证：

加热/冷却速率：验证仪器升降温速度是否符合规格。

温度准确性与均一性：使用经校准的外部温度探测仪（如Fluke温度探头）验证仪器显示温度与实际温度的偏差（准确性），以及样品孔之间的温度差异（均一性）。这是PCR结果可重复性的关键。

梯度功能验证：如果验证梯度PCR功能，需确认梯度设置温度与实际温度的一致性。

（3）硬件功能测试：检查热盖压力、lid加热温度准确性、软件与硬件通讯等。

二、伯乐CFX Duet实时荧光定量PCR系统用户日常/周期性性能验证

这是实验室用户需要定期（如每季度、每半年或根据实验室SOP）执行的核心验证。

1、精密度（重复性）验证

（1）目的：评估仪器在相同条件下多次运行的变异程度。

（2）方法：

使用已知浓度和序列的DNA/cDNA模板（通常是一个稳定表达的看家基因，如GAPDH），进行系列稀释（如10倍梯度稀释，覆盖高、中、低浓度）。

将同一样品（通常选择中等浓度）加入到整块板的多个复孔中（如至少8-10个复孔，或覆盖板的不同区域）。运行标准的qPCR程序。

（3）可接受标准：

Ct值的标准差（SD）和变异系数（CV%）：通常要求复孔间Ct值的CV < 1-2%（高浓度样品应更小，如<0.5%）。

扩增曲线形状应高度一致。

2、准确度与线性范围验证

（1）目的：验证仪器检测结果与真实值的一致性，以及在一个浓度范围内响应的线性关系。

（2）方法：

使用上述制备的系列梯度稀释模板（如5-6个数量级），每个浓度设3个复孔。

运行qPCR。

（3）可接受标准：

标准曲线的线性：计算标准曲线的决定系数（R2）。通常要求 R2 ≥ 0.990（理想情况 ≥ 0.998）。

扩增效率：根据标准曲线斜率计算，公式为 Efficiency (%) = [10^(-1/斜率) - 1] × 100%。可接受范围通常为 90% - 110%（对应斜率 -3.58 到 -3.10）。效率接近100%表明仪器检测准确。

3、灵敏度（检测限）验证

（1）目的：确认仪器能够稳定检测到的Z低模板量。

（2）方法：使用极低浓度的模板（接近预期的检测下限）进行多次重复检测（如20次重复）。

（3）可接受标准：检测到阳性信号的重复数占总数的比例（检出率）应达到预设要求（如 ≥95%）。同时，低浓度样品的扩增曲线应清晰可辨，Ct值相对稳定。

4、通道间干扰验证（针对多色检测）

（1）目的：验证多荧光通道同时检测时，彼此之间是否存在光谱串扰。

（2）方法：

准备仅含单一荧光染料（如FAM、HEX/VIC、ROX/Cy5等）的样品，分别用所有可能接收的通道进行检测。

例如，将纯FAM样品在FAM通道（主要检测通道）和HEX通道（可能串扰通道）下读取信号。

（3）可接受标准：在非指定通道检测到的信号（串扰）应低于主通道信号的某个百分比（例如 < 1%），或低于设定的阈值。

三、简化版日常监控建议

1、制备一批分装好的验证用DNA和预混板，长期冻存。

2、定期（如每月）取出一份，在CFX Duet上运行。

3、只需评估关键参数：复孔Ct的CV%、标准曲线的R²和扩增效率、熔解曲线峰型。

4、与历史数据或基线数据进行比较，监控仪器性能的长期漂移。

总结：伯乐CFX Duet qPCR仪的性能验证是一个系统过程，核心在于精密度、准确度/线性、灵敏度和特异性。定期执行这些验证是保证您的qPCR实验结果科学、可靠的基础。建议参考仪器用户手册并结合实验室自身的质量控制程序（SOP） 来制定详细的验证方案和可接受标准。