蛋白质SDS-PAGE电泳是分子生物学实验室Z核心的技术之一，其成功与否直接影响后续分析（如Western Blot）的结果。以下是一份详尽的注意事项清单，涵盖了从样品准备到凝胶染色的全流程，以及常见问题排查。

一、实验前的核心原则

1、还原与变性：确保蛋白质变性并打开二硫键，这是SDS-PAGE成功的基础。使用含SDS（变性剂）和β-巯基乙醇或DTT（还原剂）的loading buffer，并充分煮沸（通常95-100℃，5-10分钟）。

2、负电荷均一化：SDS与蛋白质结合（每克蛋白质结合约1.4g SDS），使其带上均匀的负电荷，从而让迁移率主要取决于分子量。

3、安全重要性：丙烯酰胺单体是神经毒物，操作时应戴手套，并在通风橱/操作台内配制。实验后洗手。

二、实验流程分步注意事项

A、样品制备阶段

1、蛋白浓度测定：准确测定蛋白浓度至关重要。上样量过高会导致条带过宽、拖尾、甚至堵塞凝胶；过低则条带信号弱。建议进行预实验确定良好上样量（通常10-100 µg/泳道，细胞裂解液约20-40 µg）。

2、Loading Buffer：

使用新鲜的还原剂（DTT/β-巯基乙醇），因其易被氧化失效。

煮沸后需短暂离心（~10秒），将管内壁冷凝水离心下来，避免上样体积不准确。

煮沸后的样品可立即上样，或-20℃/-80℃保存。长期冻存的样品在上样前建议再次煮沸离心。

3、对照品：

预染蛋白Marker：用于实时监控电泳进程和估算分子量。

内参蛋白（如β-actin、GAPDH）：用于评估上样均一性和实验稳定性。

B、凝胶配制阶段

1、清洗制胶器具：玻璃板、梳子、间隔条需洗净并晾干或用ddH₂O润洗，防止凝胶中出现杂质或产生气泡。

2、充分混匀：加入TEMED（催化剂）后，需立即充分混匀灌胶，因为聚合反应迅速开始。

3、避免气泡：

沿玻璃板一角或使用移液器稳定注入分离胶溶液。

灌胶后，立即在上面轻轻加一层水封（异丙醇或ddH₂O），压平胶面并隔绝氧气（氧气会抑制聚合）。

4、聚合时间：室温（约30分钟）聚合一致。倒掉水封层后，用滤纸边缘吸干残留液体，但切勿触碰胶面。

5、浓缩胶与加样孔：

灌入浓缩胶后，立即平稳插入梳子，避免产生气泡。

确保梳子水平插入，保证上样孔深度一致，否则上样时样品会溢出。

C、上样与电泳阶段

1、电泳缓冲液：使用1× SDS-PAGE Running Buffer（Tris-Glycine-SDS）。内槽（上下槽）缓冲液不要混用，因为上槽缓冲液在电泳过程中pH会发生变化。建议不要重复使用缓冲液。

2、拔梳子：垂直向上平稳拔出梳子，避免撕裂加样孔。拔完后，用注射器或移液器吸取电泳缓冲液轻柔冲洗加样孔，去除未聚合的丙烯酰胺和碎片。

3、上样技巧：

将样品吸至加样孔底部，缓慢推出，避免样品飘出孔外或冲散邻孔样品。

4、留出空泳道：在两侧或样品间上样1× loading buffer作为空白对照，防止边缘效应导致样品条带弯曲。

5、电泳参数：

浓缩阶段（积层）：使用低电压（如80V），使样品在浓缩胶中被压缩成一条窄线。此阶段溴酚蓝（指示剂）条带会被压扁。

6、分离阶段：进入分离胶后，调高电压（如120-150V）。电压过高可能导致条带弯曲（“微笑”效应）或发热过度；过低则耗时长，条带可能扩散。

7、监控：观察预染Marker的分离情况和溴酚蓝的位置。当溴酚蓝迁移至凝胶底部约0.5-1 cm时，即可停止电泳。

D、染色与脱色阶段

1、剥离凝胶：小心撬开玻璃板，根据Marker指示切下目标区域凝胶。操作时戴手套，防止污染和烫伤（如果使用热敏染色法）。

2、染色方法选择：

考马斯亮蓝染色：快速、经济，灵敏度较低（~100 ng）。

银染：灵敏度高（~1 ng），但步骤繁琐，背景控制要求高。

荧光染色（如SYPRO Ruby）：灵敏度介于两者之间，兼容质谱分析，无甲醇毒性。

3、关键点：

固定：染色前通常需要用甲醇/乙酸溶液固定蛋白质，防止其在后续步骤中扩散。

脱色：考马斯亮蓝染色后，需用脱色液（甲醇+乙酸+水）反复漂洗至背景干净、条带清晰。

保存：脱色后的凝胶可拍照，并保存在4℃的ddH₂O或7%乙酸溶液中。

三、黄金法则总结

1、制胶要均，上样要准，电泳要稳。

2、保持试剂新鲜，尤其是APS、TEMED和还原剂。

3、时刻注意温度控制：样品制备在冰上，电泳过程防止过热。

4、做好对照实验：Marker、阳性对照、阴性对照、内参对照缺一不可。

5、耐心细致：SDS-PAGE是基础但精细的技术，每一步的微小失误都可能影响Z终结果。

遵循以上注意事项，将能极大提高SDS-PAGE实验的重现性和成功率，为后续的蛋白功能研究打下坚实基础。