SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是分离蛋白质混合物的核心实验技术。以下是详细的操作步骤、原理和关键注意事项，便于您理解和操作。

一、SDS-PAGE基本原理

1、变性： SDS使蛋白质变性，破坏其二、三、四级结构，并将大量负电荷均匀覆盖在肽链上，掩盖了蛋白质原有的电荷差异。

2、电荷一致： 所有SDS-蛋白质复合物均带负电，在电场中向阳极迁移。

3、分子筛效应： 聚丙烯酰胺凝胶网状结构对不同大小的蛋白质产生不同阻力。分子量越小，迁移越快。

因此，SDS-PAGE中蛋白质的迁移率主要取决于其分子量。

二、主要实验步骤

整个过程可分为制胶、样品准备、上样与电泳、染色与分析四个阶段。

A、制胶（以不连续系统为例）

不连续系统包含浓缩胶和分离胶，可提高分辨率和条带锐度。

1、安装制胶模具

清洗玻璃板并晾干，将其固定于制胶架上，确保底部密封。

2、配制分离胶（下层胶，决定分辨率）

选择合适浓度： 根据目标蛋白分子量范围选择凝胶浓度（通常8%-15%）。

（1）小分子蛋白（<30 kDa）→ 高浓度胶（12-15%）

（2）大分子蛋白（>100 kDa）→ 低浓度胶（8-10%）

（3）混合范围（10-200 kDa）→ 常用12%

3、按配方混合： 依次加入水、30%丙烯酰胺混合液、分离胶缓冲液（如Tris-HCl， pH 8.8）、10% SDS、10%过硫酸铵（APS）和TEMED。TEMED催化聚合，应Z后加入并立即混匀。

4、灌胶： 迅速将混合液注入玻璃板间隙至约2/3高度。

5、覆盖液层： 轻轻加入异丙醇或水封层，压平胶面并隔绝空气，室温垂直放置约30分钟聚合。

6、配制浓缩胶（上层胶，使样品浓缩成一条线）

（1）弃去封层液，用滤纸吸干。

（2）按配方混合： 混合水、30%丙烯酰胺混合液、浓缩胶缓冲液（如Tris-HCl， pH 6.8）、10% SDS、10% APS和TEMED。

（3）灌胶与插梳： 将混合液加在分离胶上，立即插入样品梳，避免气泡。室温聚合约20-30分钟。

B、样品准备

1、蛋白质样品： 与5× SDS上样缓冲液混合（终浓度为1×）。

上样缓冲液成分： SDS、DTT或β-巯基乙醇（还原剂，打断二硫键）、甘油（增加密度）、溴酚蓝（指示剂）、Tris-HCl（缓冲液）。

2、变性： 将混合后的样品在95-100℃ 加热5-10分钟，使蛋白质充分变性和还原。

3、短暂离心： 加热后短暂离心，收集管壁冷凝液。

C、上样与电泳

1、安装电泳槽： 将凝固的凝胶板放入电泳槽内，加入1× 电泳缓冲液（含Tris、甘氨酸、SDS）。内外槽均需加满缓冲液。

2、拔梳与上样：

（1）轻轻垂直拔出样品梳。

（2）使用微量上样器，将准备好的蛋白样品和蛋白分子量标准品（Marker） 依次加入加样孔。

（3）关键： 记录上样顺序，Marker孔。

3、连接电源与电泳：

（1）正确连接电极（黑对黑，红对红，负极在上）。

（2）恒压电泳： 推荐先以80-90V电压电泳，待溴酚蓝指示线进入分离胶后（约30分钟），将电压提高至120-150V继续电泳。

（3）终点判断： 当溴酚蓝前沿迁移至凝胶底部约0.5-1 cm时，关闭电源。

D、染色与分析

1、取胶： 拆卸装置，小心撬开玻璃板，取出凝胶。

2、固定与染色（以考马斯亮蓝R-250快速染色为例）：

（1）固定： 将凝胶放入固定液（如甲醇:乙酸=5:1）中摇动15分钟。

（2）染色： 转移至考马斯亮蓝染色液中，摇动30分钟至数小时。

（3）脱色： 移入脱色液（甲醇、乙酸、水混合物）中摇动，期间更换脱色液数次，直至背景透明、条带清晰。

（4）成像与分析： 用凝胶成像系统拍照，根据Marker条带的位置，可绘制标准曲线并估算目标蛋白的分子量。

三、关键注意事项与常见问题

1、安全重要性：

丙烯酰胺单体具有神经毒性，操作液态丙烯酰胺或粉末时必须戴手套，在通风处配制。

电泳时勿触摸电极，防止触电。

2、制胶关键：

分离胶和浓缩胶的pH不同，是形成不连续系统的关键，切勿混淆。

APS和TEMED是催化剂，应分装保存于4℃或-20℃，避免失效。

灌胶后若聚合过快或不聚合，检查APS/TEMED的活性和用量。

3、电泳关键：

确保电泳缓冲液新鲜，且内外槽缓冲液连通（对于垂直板电泳槽）。

初始电压不宜过高，否则会导致条带扭曲（“微笑”效应）。

4、结果不佳的常见原因：

条带弥散/拖尾： 蛋白质降解或上样量过大。

条带弯曲/歪斜： 凝胶聚合不均、上样速度过快产生气泡、电泳温度过高。

分子量估算不准： 蛋白质糖基化、磷酸化等修饰会影响迁移；非还原条件也会影响。

无条带或信号弱： 蛋白浓度过低、转膜/染色失败、抗体失效（对于Western Blot）。